Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit

總一氧化氮檢測試劑盒（顯色法）

產品信息

產品描述

本總一氧化氮檢測試劑盒（Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit）利用兩步法測定總一氧化氮水平，一步先用硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase）將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，第二步再用經典的Griess reagent，對亞硝酸鹽進行定量測定，從而推算出總一氧化氮含量。

由于本試劑盒使用的是NADPH依賴的硝酸鹽還原酶，高濃度的NADPH會干擾后續檢測，因此，試劑盒使用乳酸脫氫酶（LDH）來清除NADPH，確保檢測結果的準確性。

本試劑盒以亞硝酸鈉為標準品，通過優化的檢測體系，檢測下限達2μM，且在2~80μM范圍內具有良好的線性關系。本試劑盒不僅能檢測細胞、組織或培養液中的一氧化氮含量，還能檢測血清、血漿或尿液中的一氧化氮含量。

• 當檢測細胞或組織一氧化氮含量，不建議使用RIPA裂解液，因其可能在后續實驗中產生沉淀，影響測試。建議使用一氧化氮分析用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制劑）（貨號：MP1509-100ML）。也可自行選擇適當方式制備組織或細胞樣品的裂解液，要考慮到自行選擇的方式是否存在干擾試劑盒內酶反應的可能。
• 當檢測細胞培養液內一氧化氮含量，不可使用RPMI1640等含較高濃度硝酸鹽的培養液，否則會干擾檢測。
• 所有檢測反應需避光進行。
• 由于檢測過程存在還原反應，凡是影響還原反應的試劑都需要避免，比如DTT或2-ME。
• 本試劑盒利用的是間接法測定總一氧化氮含量，如果只需粗略測定一氧化氮相對量，可選擇我司提供的一氧化氮檢測試劑盒（貨號：MX4731-500T）。如果需要直接測定一氧化氮水平，比如測定細胞內實際的一氧化氮水平，可選擇我司提供的DAF-FM DA一氧化氮熒光探針（貨號：MX4702-100T）。
• 本試劑盒對人體有害，請注意適當防護，避免直接接觸人體或吸入體內。
• 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

【注意事項】

• 反應必須避光進行。當使用96孔板進行檢測，可用鋁箔紙包裹96孔板進行避光。
• 樣品的用量上限為60μl。血清、血漿或組織勻漿液通常使用40μl足夠。樣品不足60μl，不同樣品之間的體積需要保持一致，體積不足的部分用制備或稀釋樣品所用的溶液補足。
• 可同時設置加入200μl水或PBS的2~3個孔為陰性對照，這2~3個孔僅加入水或PBS，不在加入任何其他試劑。
• 加入Griess reagent I后需輕輕混勻。
• 每次混勻后，可以1000~3000g離心數秒，把液體沉淀至管底。同時需避免各檢測孔中產生氣泡，以免氣泡干擾檢測結果。

3.2 在540nm（或520~560nm）測定吸光度。需在30min內測完，以防褪色降低靈敏度。

3.3 以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標繪制標準曲線，獲得橫縱坐標之間的函數關系式。之后將樣品OD值代入公式來計總算一氧化氮濃度。

3.4 標準曲線示例見右圖，僅供參考。實際測定時，由于反應條件、試劑盒批次差異等因素，會導致檢測結果與示例數據存在一定差異。

常見問題

• 檢測結果標準曲線良好，但樣品的吸光度很低，和空白對照接近，什么原因？

回復： 標準曲線良好說明檢測方法和檢測試劑盒基本上沒有問題，樣品吸光度低說明樣品中一氧化氮含量很低。可以采取的辦法是：1）加大樣品和標準品的使用量至60μl，其余試劑用量不變。2）把整個檢測體系每種試劑的用量加大50%，這樣可以使檢測靈敏度增加約50%。3）如果上述方法還不能解決問題，可以考慮濃縮樣品，即一方面在收集樣品的時候盡量使一氧化氮的濃度保持得較高（例如裂解細胞時采用較小體積的裂解液），另一方面可以考慮用真空干燥或真空冷凍干燥的方法濃縮樣品。

• 檢測時發現每個樣品的吸光度都非常高，什么情況？

回復：使用RPMI 1640培養液時會發生這種情況。因RPMI 1640培養液中含有高濃度的硝酸鹽從而會使樣品檢測出來的吸光度都非常高。其他含有高濃度硝酸鹽的試劑也會產生類似情況，影響氧化還原反應的試劑也可能產生類似干擾。使用過程中避免使用RPMI 1640等可能導致干擾檢測的試劑即可。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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